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探讨转录基因的克隆方法.doc


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探讨转录基因的克隆方法.doc
文档介绍:
探讨转录基因的克隆方法.doc探讨转录基因的克隆方法
1序列分析
采用进行多序列比对。基于拟南芥、水稻、毛果杨、 小立碗薛、番茄衣藻,采用软件进行多序列比较,对光皮桦 B1SPL1进行系统进化分析,所用序列来自数据库。具体的基 因名和序列号参考Salinas等的报道。按照试剂盒说明进行, 其扩增反应程序为:95°C5min;95°C5s, 60°C20s, 72°C20s, 40个循环。定量引物为51QF和51QR,内参基因Actin的引 物为,采用相对定量分析基因表达。SNP分析鉴于B1SPL1基 因组序列较长,为便于克隆和测序,将其分成A和B2段进 行克隆、SNP搜寻与分析,其中***段包含5'TJTR部分序列 和第1、2个外显子及第1个内含子、第2个内含子部分序 列共1665bp, B片段包括第2个内含子部分序列、第3个外 显子以及3' -UTR共846bpo引物51F433和51R2098用于A 片段的克隆,51F2608和51R用于B片段的克隆。以57个不 同种源的无性系植株基因组DNA为模板,采用高保真Pfu酶 进行PcR扩增,PcR扩增产物回收后采用 pEASy-Bluntcloningkit进行克隆,挑取阳性克隆进行序列 测定,每个样本至少挑3个克隆进行测序。利用软件对序列 进行分析,搜寻SNP位点、计算SNP频率及多样性指数;分 析同义突变、错义突变和无义突变情况;分析LD在光皮桦不

同群体B1SPL1基因中的延伸模式。
2结果与分析
光皮桦B1SPL1基因的克隆及其序列分析
基于光皮桦转录组序列,利用RAcE技术,克隆获得了
B1SPL1基因。序列分析结果表明,该基因cDNA序列全长 1825bp,分别包含 486bp 的 5' -UTR, 169bp 的 3' -UTR,以及 长为1170bp开放阅读框,其编码389个氨基酸。用 ProtParamtool估算推导的蛋白质的分子量约为,其等电点 为。同源分析表明,与桃、苹果mdSPLl的序列同源性最高, 分别达到67%和60%o同时,为进行后续的SNP分析,根据 cDNA序列克隆了其对应的基因组DNA序列。结果表明B1SPL1 的基因组序列全长3457bp,包含2个内含子和3个外显子, 第1个内含子长1005bp,第2个内含子为624bp, 3个外显 子分别长416bp, 134bp, 620bp,在第3个外显子处含有 miR156靶位点。进一步的蛋白结构域分析表明,B1SPL1在 蛋白质的第92-170氨基酸残基位置上含有该基因家族所特 有SBP结构域,此结构域包含2个锌指结构,其中N端锌指 结构为cys3His, c端锌指结构,另外在该结构域的c端第 150—167位置上含有核定位信号,这与相关报道相符。为分 析B1SPL1基因的系统进化关系,参照Salinas等构建了 SBP-box基因家族系统发育进化树。可见,陆地植物SPL蛋 白分化为8个分支,即group I — VIH,而B1SPL1属于group VII

这一分支,与来自水稻、拟南芥和杨树的相关SPL蛋白同 属一个分支,且与杨树的PtSBP20亲缘关系最近。B1SPL1基 因的表达分析SPL基因在植物成花过程中被认为是比较上游 的调控因。因此,本研究采用
定量PcR对B1SPL1基因在光
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  • 上传人小雄
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  • 时间2021-05-30
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